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免疫沉淀及Pulldown這些方法原理你了解多少

时间:2020-12-04     【转载】   阅读

Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作為常見的關(guān)系驗(yàn)證方法。它們可以從檢驗(yàn)的出發(fā)點(diǎn)來區(qū)分:co-IP、ChIPRIP是利用已知的蛋白檢測體內(nèi)相關(guān)蛋白、DNA、RNA,并通過蛋白抗體免疫沉淀分離目標(biāo)蛋白、DNA、RNA。Pulldown則是根據(jù)已知RNARNA pulldown)或者已知蛋白(GST pulldown)體外檢驗(yàn)相關(guān)蛋白。

 

免疫共沉淀co-IP

抗體與細(xì)胞裂解液或蛋白表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,再與蛋白A/GProteinA/G)(或二抗)偶聯(lián)的瓊脂糖微珠孵育,通過離心得到微珠-蛋白A/G(或二抗)-抗體-目的蛋白復(fù)合物。復(fù)合物沉淀經(jīng)離心洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,沸水浴5-10 min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體(輕鏈和重鏈已斷開)和靶標(biāo)蛋白。該上清混合物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離和Western blotting顯影,依據(jù)顯影后的膠片上是否有目的蛋白條帶,來判斷免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是否成功。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1: 蛋白樣品準(zhǔn)備,細(xì)胞需提前裂解

Step2: 抗原抗體結(jié)合

Step3: protein A 瓊脂糖珠與抗體結(jié)合

Step4: 免疫沉淀分離

Step5: 洗脫蛋白復(fù)合物

Step6: WB或質(zhì)譜分析

圖片1.png





染色質(zhì)免疫沉淀ChIP

ChIP是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。在生理狀態(tài)下,把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起,通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后,利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng), 將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來,以富集存在組蛋白修飾或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA片段,再通過多種下游檢測技術(shù)(定量PCR、基因芯片、測序等)來檢測此富集片段的DNA序列。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1: 交聯(lián)蛋白與DNA

Step2: 超聲破碎使染色質(zhì)片段化

Step3:細(xì)胞裂解

Step4: 抗體結(jié)合特定蛋白抗原

Step5: 通過beads沉淀復(fù)合物并洗脫

Step6: qPCR擴(kuò)增或基因測序

圖片2.png

 

 

RNA免疫沉淀RIP

主要是用來研究體內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況,利用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,通過分離純化,對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證或測序分析,了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1:靶蛋白-RNA交聯(lián)形成復(fù)合物(RNP)超聲剪切RNA鏈成小段

Step2:細(xì)胞裂解,將RNP與抗體、微珠連接

Step3:微珠-抗體-RNP形成沉淀

Step4:將RNP從微珠-抗體上洗脫,并將RNA與蛋白解交聯(lián),純化RNA

Step5qPCR檢測或測序分析

圖片3.png

 

 

RNA Pulldown

RNA Pulldown是研究RNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種技術(shù)。利用生物素標(biāo)記的RNA探針,通過與含有目的蛋白的溶液孵育,形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。復(fù)合物可以特異性結(jié)合磁珠,從而與孵育液中的其他蛋白分離。復(fù)合物洗脫后,通過蛋白凝膠電泳實(shí)驗(yàn),檢測特定的RNA與蛋白的結(jié)合情況。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1:生物素標(biāo)記目標(biāo)目標(biāo)RNA;

Step2:磁珠結(jié)合目標(biāo)RNA;

Step3:目標(biāo)RNA與蛋白結(jié)合;

Step4:通過磁場固定磁珠,將蛋白分離純化;

Step5:通過WB鑒定或質(zhì)譜檢測。

圖片4.png

 

 

 

GST Pulldown

GST Pulldown將靶蛋白-GSTGlutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶)融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。

體外檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用,用于驗(yàn)證兩個已知蛋白的相互作用,或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1Glutathione瓊脂糖珠預(yù)處理;

Step2GST融合蛋白掛柱;

Step3:細(xì)胞裂解;

Step4:將細(xì)胞裂解液上清加入beads

Step5:加上SDS上樣緩沖液;

Step6SDS-PAGE,Western Blot或者質(zhì)譜儀分析。

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案例展示

圖片6.png

ChIP案例分析:

1. 陽性對照組條帶清晰可見,陰性對照組正常,表明CHIP實(shí)驗(yàn)操作可行;

2. input對照組條帶清晰可見,表明PCR擴(kuò)增引物可用;

3. 抗體A實(shí)驗(yàn)組有目的條帶,表明基因與轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白均可發(fā)生結(jié)合。

圖片7.png

RIP案例分析:

1. 陽性對照組條帶清晰可見,陰性對照組正常,表明RIP實(shí)驗(yàn)操作可行;

2. input對照組條帶清晰可見,表明PCR擴(kuò)增引物可用;

3. 抗體A實(shí)驗(yàn)組有目的條帶,表明RNA與蛋白可發(fā)生結(jié)合。




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